1、简介
急性髓系白血病 (AML) 是一种髓系祖细胞的克隆性增殖性疾病，导致骨髓和外周血中未成熟的髓系细胞积聚。近期 AML 患者的预后得到了显着改善，这主要是由于对患者管理的风险分层治疗方法的发展 [1]。然而，老年 AML 患者、携带 FLT3 突变的患者以及具有复杂细胞遗传学异常和单体的患者的治疗仍然具有挑战性。在这方面，开发新的靶向治疗方法对于改善 AML 亚群的临床结果至关重要 [2]。
舒尼替尼是一种多靶向酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，靶向血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)、血管内皮生长因子受体 (VEGFR) 和其他组成型活性激酶，如 c-KIT。舒尼替尼已被美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准用于治疗转移性肾细胞癌 (mRCC) 和胃肠道间质瘤 (GIST) [3]。使用体外和体内 AML 模型 [4] [5]，舒尼替尼还显示可降低野生型 fms 相关酪氨酸激酶 (FLT3) 和内部串联重复 (ITD) 的磷酸化。在评估 AML 患者的安全性和有效性的临床试验中，舒尼替尼显示出分子和临床反应，但是，这是短暂的并且与显着的毒性相关 [6]。舒尼替尼与常规化疗联合使用已显示出有希望的结果。舒尼替尼与 AraC 或柔红霉素的组合显示出对 FLT3-ITD 阳性 AML 细胞的协同抑制作用 [7]。最近一项针对具有 FLT3 突变的老年 AML 患者的 I/II 期研究研究了在标准诱导和巩固化疗中加入舒尼替尼，然后维持舒尼替尼。在这项研究中，无论 FLT3 突变类型如何，25 mg/天剂量的舒尼替尼均具有良好的耐受性，并且在 59% 的 AML 患者中实现了完全缓解 [8]。在本研究中，我们评估了舒尼替尼对来自原代 AML 样本和潜在 AML 干细胞亚群的 AML 细胞系和克隆细胞的活性。
2. 材料和方法
2.1.材料 20 mM 苹果酸舒尼替尼(Sigma-Aldrich，美国)储备溶液通过溶解在二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich，美国)中制备，并储存在 -20°C。在 DMSO 中进一步稀释。 Cell-Titer blue 活力试剂盒(Promega，UK)用于研究舒尼替尼对细胞系活力的影响。 CD34-PE、Annexin V450 和 7-AAD 抗体购自 BD (BD biosciences, USA)。 CD34 微珠试剂盒购自 Miltenyi (Miltenyi Biotech, Germany)。碘化丙啶和 RNase A 购自 Sigma(Sigma-Aldrich，美国)。 Lymphoprep 和 MethoCult™(H4434 和 H4100)购自 Stem Cell Technologies(Stem Cell Technologies，加拿大)。
2.2. CD34+细胞的样品收集和分离在知情同意后收集来自正常分娩的脐带血(UCB)样品和原发性AML患者骨髓(BM)或外周血(PB)样品。本研究已根据赫尔辛基宣言获得机构审查委员会的批准。使用 Lymphoprep (Stem Cell Technologies, Canada) 通过密度梯度离心从 UCB/AML 样品中分离单核细胞 (MNC)。 UCB 用无菌 1x PBS(Gibco，Life Technologies，美国)按 1:2 稀释，并在 Lymphoprep 上分层。以 750 g 离心 30 分钟后，从梯度中收集单核细胞。根据制造商的方案(Miltenyi Biotec，德国)，使用 CD34 Microbead 试剂盒通过阳性选择从 MNC 中富集 CD34+ 细胞。通过在 BD FACS Aria III (BD biosciences, USA) 流式细胞仪上用抗 CD34-PE 标记来检查分离的 CD34+ 细胞的纯度。在本研究中，我们仅包括纯度高于 95% 的样品。对富集的样品进行活力计数，并冷冻保存在含 10% DMSO 的胎牛血清中，并储存在液氮中以备下次使用。
2.3.细胞培养
K562(红白血病)、HL60(急性早幼粒细胞白血病)和 NB4(急性早幼粒细胞白血病)细胞在 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基(Gibco，Life Technologies，USA)中培养，并添加 10% FBS(Lonza，USA)并孵育在加湿的 5% CO2 37˚C 培养箱中。所有细胞系均购自 Cell Lines Service (CLS GmbH, Germany)。 AML 单核细胞和分选的人类造血干/祖细胞在无血清扩增培养基(干细胞技术，加拿大)中培养，用于药物测定。
2.4.细胞增殖
测定 使用 Cell-Titer blue 细胞活力试剂盒进行细胞增殖测定。简而言之，在 96 孔板中，将 1 × 104 细胞与不同剂量的舒尼替尼一式四份孵育，总共100 µL 培养基的体积。 DMSO 处理的细胞用作对照。孵育 48 小时后，加入 20 µL 细胞滴定度蓝色试剂，并在 37°C 孵育 2 小时后，在酶标仪(Spectramax i3，Molecular Devices，美国)上记录 560/590 nm 的荧光。细胞活力百分比计算为处理细胞的荧光值/对照的荧光值×100。至少进行了三个独立实验。
2.5.细胞凋亡检测
进行膜联蛋白 V 测定以检测凋亡细胞。简而言之，将 2 × 105 细胞接种在 6 孔板中，并用各种浓度的舒尼替尼(包括 DMSO 处理的对照)处理并孵育 48 小时。收获细胞并用膜联蛋白 V450 和 7-AAD 染色。通过使用 BD FACS Aria III 采集 10,000 个细胞来分析染色样品。
2.6.细胞周期分析
将细胞以每孔 5 × 105 细胞的密度接种在 6 孔板中，并用不同剂量的舒尼替尼处理。 48 小时后，收集细胞并用冰冷的乙醇固定，并在 -20°C 下保持 1 小时。洗涤细胞，然后用碘化丙啶 (PI) 染色溶液(PI 40 µg/ml，RNase 20 µg/ml)染色。通过使用 BD FACS Aria III 分选仪获取 20,000 个排除双峰的细胞进行流式细胞术分析。
2.7. Aldefluor 检测和流动细胞分选
按照制造商的说明(Aldefluor，Stem Cell Technologies，Canada)在 AML 患者 MNC 中评估醛脱氢酶 (ALDH) 活性。添加 DEAB 以创建阴性对照。在一些样品中进行了与抗 CD34-VioBlue(Miltenyi Biotech，德国)的共染色。然后通过分选 ALDH+ 细胞 (BD FACS Aria III) 分析和分离染色样品。
2.8.氟氯化碳检测
通过在舒尼替尼或 DMSO(对照)处理 24 小时后接种细胞进行集落形成细胞 (CFC) 测定。如 [9] [10] 所述，通过在 Methocult 中以 20,000 – 60,000 个细胞/ml 接种未分选的 AML 细胞或以 10,000 个细胞/ml 接种 ALDH+ /CD34+ 细胞进行 AML-CFC 测定。 10-14天后评价菌落。通过接种 1000 个细胞/ml Methocult 进行药物处理的正常 CD34+ 细胞的 CFC 测定，并在 12 天后进行评估。
2.9.统计分析
使用Graphpad Prism(Graphpad Software Inc，USA)生成细胞增殖曲线。数据表示为平均值±SEM。未配对的双尾学生 t 检验用于所有体外细胞系实验和 AML-CFC 检测。 p < 0.05 被认为是显着的。 Mann-Whitney U 检验用于确定两个单独的 AML 患者组之间的显着差异。
3. 结果
3.1.舒尼替尼在不同白血病细胞系中的抗增殖作用
为了探索舒尼替尼(图 1(a))对 AML 细胞的抗增殖作用，在增加舒尼替尼浓度的情况下培养人 HL60、K562 和 NB4 细胞系。处理 48 小时后，使用 Cell-Titre Blue Kit 评估细胞增殖和活力。如图 1(b) 所示，舒尼替尼以剂量依赖性方式抑制 HL60、K562 和 NB4 细胞增殖，IC50 值分别为 5.7、4.4 和 7.3 μM。为了确定舒尼替尼抗增殖作用的精确机制，研究了膜联蛋白 V 染色和细胞周期分布图。如图 1(c) 和图 1(d) 所示，在舒尼替尼处理的细胞中观察到膜联蛋白 V 阳性细胞的剂量依赖性增加，表明细胞凋亡是舒尼替尼对 AML 细胞系的抗增殖作用的原因。此外，如图 1(e) 所示，AML 细胞暴露于舒尼替尼 48 小时导致代表凋亡细胞的亚 G1 细胞群数量增加。增加舒尼替尼的剂量导致所有测试细胞系的 S 期细胞比例随之降低，表明细胞增殖减少。
3.2.舒尼替尼对原代AML克隆形成细胞的影响
为了评估舒尼替尼对原发性 AML 患者来源的白血病细胞的影响，在进行 AML-CFC 测定之前，将 AML-BM 或 PB 样品在 7μM 舒尼替尼或 DMSO 存在下孵育 24 小时。使用正常 UCB CD34+ 进行比较。如图 2(a) 所示，与 DMSO 处理的对照(±6.8%;n = 4)相比，7 µM 舒尼替尼处理导致平均 AML-CFC 减少 75%。用 7 µM 舒尼替尼处理正常 UCB CD34+ 细胞显示仅减少 29%(±6.77%;n = 5)。在 20 个新诊断的 AML 样本中检查了 ALDH 活性。与原始细胞数 <20% 的患者相比，原始细胞计数 >20% 的患者表现出更高的 ALDH 活性(U = 6.0，p = 0.007，图 2(b))。为了检查舒尼替尼对潜在白血病干细胞的影响，我们对来自两名 AML 患者的 ALDH+ CD34+ 和 ALDH-细胞进行了分选，并在有或没有 7μM 舒尼替尼的情况下进行克隆形成试验。 ALDH- 细胞没有显示任何 CFC 生长，但是，仅在 ALDH+ 中检测到集落排序的单元格。在舒尼替尼存在的情况下，ALDH+ AML 细胞在两个测试的 AML 样本中都失去了克隆形成潜力(图 2(d)，图 2(e))。从另一个显示 CD34+ CD133+ 细胞的 AML 样本中，筛选出各种亚群，如图 2(d)所示。只有表达 CD34 的细胞形成集落。用舒尼替尼处理 CD34+ CD133+ 分选细胞和 CD34+CD133− 细胞可减少集落数
4。讨论
RTK 中的激活突变在 AML 中很常见，并且具有不良的临床结果。 FLT3 突变包括内部串联重复 (FLT3-ITD) 和酪氨酸激酶结构域突变 (FLT3-TKD)，在几乎 30% 的新诊断 AML 中发现 [11]。这些突变使 AML 预后不良 [12]。据报道，在 3% – 15% 的 AML 病例中发生 KIT 受体基因突变 [13] [14]，并且在核心结合因子 AML (CBF-AML) [15] 中的比例显着更高。 KIT 突变使 CBF-AML 预后不良 [16] [17]。由于 RTK 突变的高频率和较差的临床结果，一直在努力开发 RTK 的靶向抑制剂。许多化合物已进入临床试验，并已证明作为单一药物或与常规化学疗法组合的不同功效 [8] [18] [19] [20]。舒尼替尼是一种可口服的多靶向 TKI，主要靶向 VEGFR、PDGFR、CD117 (c-KIT) 和 FLT3 [21]。尽管舒尼替尼的临床研究显示了一些有希望的结果，但迄今为止尚未评估舒尼替尼对克隆性白血病细胞和 ALDH+ 潜在白血病干细胞的影响。在本文中，我们能够证明舒尼替尼对具有不同 IC50 值的三种髓系白血病细胞系(K562、HL-60 和 NB4)的有效抗增殖作用。与之前发表的 K562 和 NB4 细胞 [22] [23] 报告的 IC50 值略有不同，可能是由于研究生存能力的时间点不同。我们能够证明舒尼替尼在 AML 细胞系中诱导剂量依赖性细胞凋亡。早先在其他白血病和非白血病细胞系中也报道了类似的发现 [22] [24]。
为了研究舒尼替尼对克隆性 AML 细胞的影响，我们在 CFC 测定中评估了具有 >20% 原始细胞的原发性 AML 患者。与脐带血来源的正常 CD34 细胞相比，AML 细胞中克隆存活的损害更为明显。舒尼替尼优先杀死 AML 细胞而不是正常 CD34 细胞的主要原因可能是 AML 细胞依赖多种 RTK 进行增殖。先前对 AML 中体外 FLT3 抑制的研究表明，FLT3 的 mRNA 水平与对 RTK 抑制剂来他替尼和 PKC412 的反应之间没有明确的关系 [25]。对 FLT3 抑制剂反应的这种不一致可能是由于参与 AML 细胞信号传导的其他 RTK。为了在 AML 样本中寻找潜在的干细胞标志物，许多研究小组已经描述了 ALDH+ 细胞在 AML 干细胞中的富集 [26] [27]。可以在 24 个 AML 样本中分析 ALDH+ 细胞，但可以从仅 2 个样本中分选出足够数量的细胞用于舒尼替尼的体外靶向实验。在原始细胞百分比超过 20 的患者中观察到更高的 ALDH 表达。此外，ALDH 表达与高 CD34% 相关(数据未显示)。鉴于在 ALDH 亮或 ALDH 中间母细胞中存在白血病干细胞的报道 [27] [28]，我们的实验旨在使用舒尼替尼靶向这些潜在的 LSC。我们的结果强调了舒尼替尼消除潜在 LSC 的可能性。在这项有限的研究中无法详细阐述舒尼替尼对 ALDH 阳性 AML 细胞的作用机制。在第三位 CD34 高度阳性并共表达 CD133 的患者中，只有表达 CD34 的细胞形成集落。 CD34+ CD133+ 细胞以比 CD34+CD133- 细胞更高的频率形成集落，表明更原始的克隆形成特征。尽管已经在 UCB 衍生的正常细胞中证明了 CD34+ CD133+ 和 CD34+ CD133- 之间的功能层次结构，但迄今为止还没有研究证明在 AML 样本中存在任何此类功能层次结构 [29] [30]。虽然我们的体外结果确实表明形成白血病集落的能力存在功能层次，但需要体内研究来充分表征这种层次。
5. 结论
我们的研究强调了 TKI 抑制剂在靶向克隆性 AML 细胞和潜在 AML 干细胞方面的相关性。我们的数据支持表达 ALDH 的 AML 细胞功能层次的证据。此外，我们的数据表明舒尼替尼在体外对潜在的 LSC 候选者有很强的活性。
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