不同细胞环境中不同水平的 Bcl-2 家族蛋白可能有助于解释未刺激和刺激的 CLL 细胞对 venetoclax 的不同反应。我们提出，凋亡应激信号是白血病转化的必然结果，并导致促凋亡 BH3 蛋白的激活，因此必须存在足够的抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白以防止细胞凋亡，这种情况称为“引发”。51 循环 CLL细胞似乎主要依赖 BCL-2 本身来生存。因此，venetoclax 从预加载的 Bcl-2 中置换活性 BH3 蛋白，从而允许 Bax 激活、线粒体外膜中的孔形成和随后的细胞死亡(图 7Bi)。
相比之下，用 2S、IL4 或基质细胞刺激模拟微环境存活信号会导致大多数患者细胞对 venetoclax 产生抗性(图 1、 、2、2 和 4)。这种抗性可以部分通过抗凋亡蛋白 Mcl-1、Bcl-xl 和 A1 的上调和促凋亡 Bim 的下调来解释(图 7Bii)。 Bcl-xl 和 A1 在 CLL 的淋巴结模型中引起对 ABT-737(Bcl-2 和 Bcl-xl 的抑制剂)的抗性。4 NF-κB 介导的淋巴结中抗凋亡 Bcl-2 家族成员的上调呈负相关7,52 和 Bcl-xl、Mcl-1 和 A1 水平的增加可介导 CD40 激活细胞中的 venetoclax 抗性 16。 与这些观察结果一致，抗凋亡 Bcl-2 蛋白的上调和在我们的 CD40L 共培养 CLL 细胞中也检测到促凋亡 Bim(数据未显示)，最有可能解释基质诱导的对 venetoclax 的抗性(图 4A-B;补充图 3A-B)。
我们的研究提供了对微环境诱导对维奈托克耐药的患者特异性机制的洞察，并表明与 KI 联合可能会提高维奈托克的治疗效果。许多信号转导通路控制 Bcl-2 家族成员的转录、翻译、翻译后修饰或降解。 53,54 因此，微环境激活的通路可能因患者而异，我们的研究证实了这一点。 -蛋白质水平的特定模式(图 6A;补充图 6A)并且与常规 CLL 预后标志物缺乏相关性(图 4C-D)。我们发现广谱 KI 与 venetoclax 联合使用时有效，这与防止需要抑制多种途径的抗凋亡蛋白上调一致，类似于急性髓系白血病模型中 Mcl-1 和 A1 的调节。 55
重要的是，尽管药物反应存在显着的患者间变异性，但该筛选将舒尼替尼(一种广泛特异性的 KI)确定为 FDA 许可的最有效的 KI，足以抵消大多数患者细胞中的维奈托克耐药性。舒尼替尼作为单药治疗 CLL 的活性只有中等，血浆浓度达到 0.25 µM。36,56-60 事实上，我们的研究证实舒尼替尼作为单药治疗未受刺激和 2S-/IL4- 缺乏疗效在这些浓度下刺激 CLL 细胞。舒尼替尼的反应与对 Bcl-2 本身以外的 Bcl-2 家族蛋白的影响有关，这可能解释了它作为单一药物未能杀死 CLL 细胞(作为单一药物平均杀死 30%;补充表 1)。相反，舒尼替尼足以阻断 Mcl-1、Bcl-xl 和 A1 的微环境上调以及促凋亡蛋白 Bim 的下调，从而克服对 venetoclax 的抗性(图 7Biii)。有趣的是，navitoclax 在杀死大多数患者的细胞方面表现出很高的效率，这可能是由于同时抑制 Bcl-2 和 Bcl-xl。与图 4 和 5,5 中报告的数据一致，舒尼替尼联合 venetoclax 与 navitoclax 一样有效，这可能是由于间接抑制了 Bcl-xl 和其他抗凋亡 Bcl-2 蛋白。作为 Bcl-xl 的间接抑制剂，舒尼替尼可能是临床使用的更好替代品，而不会产生由 navitoclax 引起的血小板减少症的靶向副作用。61-64 舒尼替尼靶向多种酪氨酸激酶，如 PDFR、KIT、FLT3 和 VEGF ，表明这些途径在 CLL 生物学中的作用相对较少。
相比之下，目前获批的 BTK 抑制剂依鲁替尼(最近建议与 venetoclax 65 以及 PI3Kδ 抑制剂 idelalisib 联合治疗)在杀死受刺激的 CLL 细胞方面不如舒尼替尼与 venetoclax 有效。在我们的验证研究中测试的药物浓度在每种 KI 的临床可达到浓度范围内，据报道舒尼替尼可达到的血浆浓度为 0.25 µM、0.5 µM 和高达 1.1 µM，56-60 依鲁替尼 (NCT01105247)， 66 和 idelalisib (NCT00710528, NCT01090414), 48。
其他 KI 等因为达沙替尼 67-71 和 flavoperidol72-74 被确定为具有高总杀灭率与 venetoclax(图 3A，分别为箭头和箭头)。在体外与维奈托克联合使用时，达沙替尼在 31 种获批药物中排名第 10，其维奈托克增强作用处于中等水平，仅在 13 名患者中的 5 名中检测到(图 3A-B，箭头)。因此，没有对其进行更详细的审查。在 62 种 FDA 许可和试验药物中，单药毒性最高的 KI 是细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 抑制剂 alvocidib(flavopiridol)，单药治疗的平均死亡率为 86%(320 种 KI 中的第 1 位) ; 补充表 1)。与 venetoclax 相结合，检测到高总杀灭率(图 3A，箭头)，因此检测到几乎为零的 venetoclax 增强效应(图 3B，箭头)。 Alvocidib 在晚期氟达拉滨难治性 CLL 患者中具有较高的临床活性;然而，急性肿瘤溶解综合征限制了其在临床上的应用。74 鉴于肿瘤溶解综合征与 alvocidib 和 venetoclax 相关，9,74 将这两种药物联合使用可能毒性太大。
我们的结果表明，基于筛选的个性化药物选择可以识别临床相关药物，这些药物可以通过改变微环境信号通路来克服对维奈托克的耐药性(图 7Biii)。对个体患者进行大量 KI 的高内涵筛选是一种可行且有效的方法，可用于确定有效的 venetoclax 个人联合疗法。鉴于我们通过 2S 和 IL4 介导的 CLL 细胞刺激获得的筛选结果在基质共培养模型中得到进一步证实，我们的检测系统提供了一个合理的模型，可以强调体内 CLL 对治疗最耐药的情况，使鉴定在这些隔室中起作用的药物。然而，我们的结果与体内耐药性的直接相关性仍有待确定。
对于已确定的药物组合的临床使用，可能需要调整剂量，考虑到 venetoclax (99.9%)9 以及激酶抑制剂舒尼替尼 (95%)、75 依鲁替尼 (97%)、76 的高血浆蛋白结合率和 idelalisib (85%)。48 然而，我们的研究表明，当应用于含有混合人血浆的培养基中的细胞时，舒尼替尼和 venetoclax 的疗效仅略有降低，但依鲁替尼和 idelalisib 的疗效并未降低(补充图 1 和 5)。
药代动力学和药效学的相似性，包括通过 CYP3A4 对 venetoclax 和 3 KIs 的代谢，48,75-78 将需要在体内仔细共同给药。重要的是，与舒尼替尼联合使用时，venetoclax 在 10 nM 时有效，该浓度远低于临床耐受剂量 9，这确实可以允许剂量调整。需要在 CLL 中联合 venetoclax 和舒尼替尼的 1/2 期临床试验来检验我们的假设。
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