布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂伊布替尼改变了对CLL患者的管理，但它在体外并不能诱导大量的细胞凋亡。人们对BTK抑制剂杀死CLL细胞的能力的机制并不完全了解。我们小组之前开发了BH3分析，这是一种功能性检测方法，可确定细胞是否接近凋亡的阈值，这种特性被称为 “线粒体启动”。这种技术的一个新变种，动态BH3分析（DBP），在细胞死亡发生之前测量早期药物诱导的线粒体凋亡信号的变化。利用DBP，我们以前发现伊布替尼增加了CLL细胞中线粒体BCL-2的依赖性，从而使细胞对BCL-2抑制剂venetoclax（以前的ABT199/GDC-0199）敏感。然而，目前仍不清楚这些是依鲁替尼对BTK的靶向效应，还是依鲁替尼对其其他靶点如ITK或TEC激酶的非靶向效应。在此，我们研究了acalabrutinib，一种目前正在进行临床试验的第二代高特异性BTK抑制剂，以确定选择性的BTK抑制是否会增加CLL细胞中BCL-2的依赖性。
从CLL患者中分离出单核细胞，在NKTert基质细胞存在的情况下，用acalabrutinib（由Acerta提供）单独或与venetoclax（APEX生物技术）联合进行体外治疗。然后按照以前的描述，通过在BD FACS Fortessa上测量细胞色素c的释放来进行BH3分析和动态BH3分析。细胞活力测定和西方印迹分析是按照标准方案进行的。用学生t检验或单因素方差分析来比较药物处理，P<=0.05为显著。
为了验证我们之前发现的伊布替尼增加线粒体BCL-2的依赖性，我们首先在另外3名患者身上重复了之前的体外伊布替尼实验，发现了类似的结果。接下来，我们对以前未经治疗的CLL患者的5个外周血样本进行了DBP，使用acalabrutinib、venetoclax或其组合的体外治疗。与我们对伊布替尼治疗的发现一致，阿卡拉布替尼b增加了BCL-2的依赖性，所有患者样本对BAD BH3肽的引物（”delta引物”）都有>20%的增加，而通过BIM BH3肽测量的总体引物（所有患者都<20%）没有增加。此外，它没有改变BCL-xL或MCL1的依赖性，分别由其特定肽HRK或MS1测量。相反，venetoclax增加了线粒体引物的整体水平，对BCL-2的依赖性影响很小。当这两种药物结合使用时，整体引物和BCL-2的依赖性都增加了。伊布替尼对BCL-2依赖性的增加导致对venetoclax的敏感性增强（p=0.0005）。
为了评估这些体外效应是否能在体内复制，我们接下来使用来自阿卡拉布替尼首次人体一期临床试验（NCT02029443）的5名CLL患者样本进行DBP。通过比较治疗前的样本和阿卡拉布替尼单药治疗4周后获得的样本来计算德尔塔引物。与我们的体外数据一致，阿卡拉布替尼治疗选择性地增加了体内线粒体BCL-2的依赖性（图1B），而不改变BCL-XL或MCL-1的依赖性，整体引物略有下降。为了进一步了解线粒体引物变化的分子机制，我们对BCL-2家族蛋白做了Western blot分析，发现阿卡布替尼治疗后，促凋亡的BIM的表达增加。
用acalabrutinib选择性地抑制BTK，可增强线粒体BCL-2的依赖性，增加CLL细胞对BCL-2抑制剂venetoclax的敏感性。诱导促凋亡蛋白BIM的表达为这些效应的机制提供了初步线索。这些数据强烈地表明，我们以前发现的伊布替尼对BCL-2的依赖性增加是一种BTK特异性效应。我们的发现为支持结合BTK和BCL-2抑制的临床试验提供了一个强有力的临床前理由。更广泛地说，我们还证明了DBP可以在体内治疗的病人样本上利用，合理地构建治疗癌症的靶向药物组合方案。
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