尽管总生存率低得令人无法接受，复发率也很高，但大多数急性髓性白血病（AML）患者的标准诱导治疗在过去40年里没有改变，这强调了目前化疗的不足，也强调了对新疗法的需求。参与增殖、分化和生存的PI3K/mTOR途径，已被证明在50-80%的AML患者中是构成性活跃的。PI3K抑制剂有希望的临床前数据已经被令人失望的临床结果所掩盖了。PI3K/mTOR的抑制已被证明会导致ERK的补偿性激活，从而使细胞存活。因此，必须针对这两种信号通路来诱导AML细胞死亡。
然而，其他生存机制在PI3K/mTOR和ERK被抑制后可以保持不变。AML细胞可以通过抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的上调来逃避细胞死亡。尽管使用Bcl-2选择性抑制剂ABT-199（Venetoclax）的II期AML临床试验的结果显示了有希望的结果，但所有接受ABT-199治疗的患者在短时间内就复发了（复发的中位时间为2.5个月）。
因此，我们假设针对PI3K、mTOR、ERK和Bcl-2信号网络将导致针对AML的卓越抗白血病活性。为了开始我们的调查，我们首先考虑使用新型PI3K/mTOR双重抑制剂VS-5584来抑制AML细胞中的PI3K和mTOR。通过MTT测定，VS-5584的敏感性在AML细胞系（n=7）和原发性AML患者样本（n=43）中有所不同，在AML细胞系中的IC50s范围为303 nM至1.4 µM，在原发性AML患者样本中为7 nM至5.3 µM（IC50中值为1.1 µM）。Annexin V/Propidium iodide染色和流式细胞仪分析显示，VS-5584诱导的细胞死亡包括caspase非依赖性凋亡，因为缺乏PARP和caspase-3的裂解和线粒体外膜电位的变化，以及泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK无法阻止细胞死亡。西方印迹分析显示，VS-5584处理导致AKT（S473和T308）和S6（S240/244）的磷酸化减少，表明PI3K和mTOR都受到了抑制。然而，检测到ERK（T202/204）的磷酸化增加，这可以被ERK选择性抑制剂SCH772984所取消。尽管VS-5584和SCH772984的组合确实导致了细胞死亡的协同诱导，但在一些AML细胞系和原始患者样本测试中，细胞死亡的水平并不高。尽管Z-VAD-FMK可以部分防止短时间（12小时）暴露于VS-5584和SCH772984的AML细胞的死亡，但它不能挽救长时间药物暴露（48小时）后的细胞。
印迹分析显示，抑制PI3K/mTOR后，Mcl-1下调，Bim上调，而联合抑制PI3K/mTOR和ERK则进一步增强。Bim的shRNA敲除和Mcl-1的过表达至少部分阻止了VS-5584和SCH772984联合诱导的早期细胞死亡，表明Bim和Mcl-1在联合诱导的细胞死亡中发挥重要作用。有趣的是，Bcl-2的免疫沉淀显示，在VS-5584和SCH772984联合治疗后的AML细胞中，Bim与Bcl-2的结合增加，而加入ABT-199后，这一现象被取消，这表明增加的Bim与Bcl-2结合，阻止了其增强细胞死亡。与对照组、单一药物处理或任何两种药物组合相比，三种药物组合诱发的细胞死亡明显增多，而且至少部分是通过内在凋亡途径介导的，Z-VAD-FMK能够部分阻止三种药物组合诱发的细胞死亡就证明了这一点。用VS-5584、SCH772984和ABT-199组合处理正常人CD34+细胞，对集落形成没有明显的影响，这表明这三种药物组合能使正常造血干/祖细胞得到保存。
综上所述，我们的研究结果表明，抑制PI3K/mTOR和ERK能协同诱导AML细胞的死亡，而加入ABT-199能提高疗效。因此，我们的数据支持将PI3K、mTOR、ERK和Bcl-2信号网络作为治疗AML的目标。
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