Venetoclax是一种口服的高选择性BCL2抑制剂，被批准作为单药或与利妥昔单抗或obinutuzumab联合治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）。尽管完全反应率高达50%，继发性耐药是治疗失败的最常见原因。 迄今为止，在接受venetoclax治疗的CLL患者中观察到的耐药机制包括：（1）具有复杂核型、BTG1突变和CDKN2A/B7畸变的克隆的早期生长；（2）获得BCL2突变（Gly101Val），减少venetoclax与BCL的结合；以及（3）其他促生存蛋白BCL-XL和MCL1的过度表达。
在所有这些情况下，一个重要的观察结果是耐药CLL肿瘤区间内突变细胞的亚克隆性。 事实上，BCL2 Gly101Val抗性突变和MCL1高度表达的CLL细胞的比例已被报道，从一个小的亚克隆到肿瘤区块的大部分，变化很大。 鉴于迄今为止在患者中观察到的BCL2 Gly101Val突变的亚克隆性，因此有可能在这一亚群中专门出现额外的耐药机制（包括最近描述的候选BCL2耐药突变Asp103Tyr10），我们调查了使用venetoclax的进展期CLL患者，这些患者携带亚克隆的BCL2 Gly101Val突变，以进一步解释这些患者的临床耐药。
通过敏感的等位基因特异性液滴数字聚合酶链反应（ddPCR），从我们机构进行的3个早期临床试验的67例重度预处理复发CLL患者中发现了11例具有BCL2 Gly101Val突变的进展期CLL患者，其中7例在BCL2 Gly101Val突变的原始报告中描述过；4例患者后来在疾病进展的样本中新检测到Gly101Val突变（补充材料，可在血液网站上找到）。使用流式细胞仪评估的样本肿瘤负担和ddPCR确定的变异等位基因频率（VAF）定量，携带BCL2 Gly101Val突变的CLL肿瘤区段的比例从非常小的亚克隆（0.1%）到CLL区段的大部分（68.4%），与以前的观察一致。
BCL2基因中GC核苷酸的比例很高，导致变异体检测的技术难题。因此，我们同时使用了（1）数字新一代测序（NGS），使用单引物延伸和独特的分子指数，以避免扩增子引物交叉嵌合并进行序列错误校正；（2）基于杂交的BCL2靶点富集，并通过敏感的肿瘤专用生物信息学管道为低水平变体调用进行变体调用（补充方法）。使用这种方法估计整个BCL2编码区的检测极限是0.5%的VAF，代表了比以前使用的NGS技术（补充方法）的灵敏度和特异性高约10倍。
11名患者中的10名（91%）检测到除Gly101Val之外的BCL2突变。每个病人观察到的突变中位数为3个（范围为1-7）。在6名患者的Asp103密码子上观察到重复性突变，并观察到氨基酸替换为酪氨酸（Tyr）、谷氨酸（Glu）和缬氨酸（Val）残基。P4口袋中的Asp103残基对于venetoclax的氮杂吲哚分子与BCL2的氢结合非常重要。在我们的队列中观察到的其他突变是Val156Asp（位于P2口袋的底部，靠近venetoclax的氯苯基）以及一个框内插入（Arg107_Arg110dup），预测为重复并延长了分隔α2和α3螺旋的4个氨基酸序列。据我们所知，Asp103/Val156替换和Arg107_Arg110dup以前没有在癌症数据库或文献中描述过，只有以前的一个案例报告说Asp103Tyr发生在一个用venetoclax治疗的CLL患者身上。与Gly101Val一样，这些观察支持这些突变在venetoclax耐药方面的特异性。
此外，还观察到Ala113Gly和Arg129Leu突变。这两个突变以前都在B细胞淋巴瘤中观察到过，其中Arg129是BCL2在淋巴性恶性肿瘤（COSMIC）中经常发生突变的密码子。重要的是，在96名未接受venetoclax治疗的CLL患者中没有观察到这些突变。Asp103Glu/Tyr密码子变体、Val156Asp和Arg107_Arg110dup使用等位基因特异性ddPCR检测进行了正交验证，在接触venetoclax之前收集的6名患者的现有样本中无法检测到。
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